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下面的操作步骤是针对在1.5 mL塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1. 根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入1 mL溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1 mL溶液A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL溶液A的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c) 对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL溶液A，用匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/ mL溶液A，否则十分容易产生DNA污染。
d) 对RNALOCKER保存组织：先用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备氯仿(1 mL溶液A需0.2 ml氯仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。
3. 12,000 rpm室温离心3-5分钟。
4. 将上清液（约0.6-0.8 mL的无色透明水相，有时水相比重大时，水相在下层，有机相即蓝相在上层，吸取时应吸取透明水相）转移到一个干净的1.5 mL塑料离心管中。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100 uL上清液不取。同时吸取上清时*好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 加入等体积的溶液B，充分颠倒混匀。
6. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
7. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中， 12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加0.7 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。
9. 加0.3 mL通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
10. 室温12,000 rmp离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的使用。
11. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入50-100 uL RNA洗脱液。
12. 室温12,000 rmp离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA的电泳检测：本试剂盒提取的RNA*好用甲醛变性胶电泳，如果在非变性的普通琼脂糖胶（in TAE或TBE buffer）上电泳，一定要使用RNA专用上样液RNAon（操作详见RNAon使用手册），千万不要使用常用的DNA上样液，因为DNA上样液没有经过去RNase处理，也不能将RNA变性，得到的带型将十分杂乱。
14. RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
15. RNA产量产率测定：将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16. RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。
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