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Western blot 条带分析

Western blot 条带分析

跑过WB的童鞋都知道,有时候显影出来的结果简直逆天到让你怀疑人生,怀疑自己。不过,世间万物均有迹可寻,在这里,小编根据自身经验以及其他小伙伴的经历,对各种奇葩结果进行一番总结归纳,快来瞅瞅吧,说不定就有你的呢。

 

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问题 可能原因 验证或解决办法
背景高 封闭不充分/未加封闭剂 延长封闭时间
更换合适的封闭剂(脱脂奶粉、血清、BSA等)
一抗浓度过高 增加一抗稀释倍数
抗体孵育温度过高 4℃孵育
二抗非特异性结合 设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应
洗膜不充分 增加洗涤次数
膜不合适 NC膜比PVDF膜背景低
膜干燥 保证充分的反应液,避免出现干膜现象
没有阳性条带或很弱 一抗、二抗等不匹配 订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参来验证二级检测系统的有效性
一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度,延长孵育时间
封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 封闭时使用温和的去污剂,如Tween-20
更换封闭剂(脱脂奶粉、BSA、血清或明胶等)
一抗不识别目的物种的靶蛋白 检查说明书,或做ClustalW比对,设阳性对照
样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低(抗原无效) 设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白
转膜不充分,或洗膜过度 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜
过度封闭 使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间
一抗失效 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用
二抗受叠氮钠抑制 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂)
酶和底物失效 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物
曝光时间过短 延长曝光时间
多非特异性条带或条带位置不对 细胞传代次数过多,导致其蛋白表达模式分化 使用原始或传代少的细胞株,或多做平行实验
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式:乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等 查文献,使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小
蛋白样本降解 使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂
新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式 查其它文献报导,或BLAST搜寻,使用说明书报导的细胞株或组织
一抗浓度过高 降低抗体浓度,可以减少非特异性条带
二抗浓度过高 产生非特异性结合 降低抗体浓度,增加二抗对照
选择特异性更强,只针对重链的二抗
抗体未纯化 使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带
蛋白存在二聚体或多聚体 SDS-PAGE电泳上样前,煮沸10 min, 以增强蛋白质解聚变性
背景有白色/黑色斑点 转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
暗片现白条带 一抗或二抗加入过多,导致高浓度HRP把底物消耗过快 稀释抗体的浓度
目的条带过低/过高 SDS-PAGE胶浓度选择不合适 调整胶浓度,分子量大的蛋白用低浓度胶,分子量小的蛋白用高浓度胶
“微笑”条带 迁移过快 降低电泳速度,低温电泳(冷室)
电泳温度过高
条带拖尾 蛋白量太大 摸索*适蛋白量
一抗浓度太高 降低一抗浓度,减少孵育时间,同时洗涤时严格按照要求时间和次数进行
一抗孵育时间太长
出现重影 压片时,轻微移动了一段距离 X光片放上去之后,就不要动了,即使放歪了也没关系
出现非均一性背景 膜干燥 在每一步的操作过程中,都要注意不要让膜干燥
某个条带变形 凝胶中存在气泡或不溶性颗粒 配胶过程中要小心,使用无杂质的液体
条带呈哑铃状 凝胶配制不合格 充分混匀,防止胶凝固后不均一
拔梳子时要小心,避免胶孔变形
*边缘条带弯曲 电泳电流不均一 换用新的电泳槽
不使用两边的两孔
条带出现纵向条纹 样品中含有不溶性颗粒 去除样品中的不溶性颗粒
转膜不充分 膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol浸透膜
靶蛋白分子量小于10,000 选择小孔径的膜,缩短转移时间
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液
甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

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