乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞生理功能的影响及作用机制初步探讨
血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell,VEC)为裱衬于整个心血管系统内表面的单层扁平鳞状细胞,是血管壁与血液之间的分界,是形成心血管封闭系统的形态基础和血管通透性的主要屏障,能维持血液的正常流动状态,并将血管内外分开,调节血管内外的物质交换,起到屏障作用。Ley等(1995)的试验研究认为血管内皮细胞还是一个活跃的代谢及***器官,可分泌多种炎症介质和细胞因子,如前列腺素(PGs)、血栓素A2(TXA2)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、粘附因子(ICAM-1)、E-选择素(E-selecting)、 P-选择素(P-selectin)、生长因子等,并能激活NF-KB(nuclear factor),在机体组织的凝血与抗凝血、**应答及炎症反应的调控等方面均起着重要作用。血管内皮细胞在人体的多种生理和病理过程中均发挥着重要作用,是当前实验研究的热点课题,而其中研究较为深入的内容之一就是人脐静脉血管内皮细胞,相对于其他血管内皮细胞而言,人脐静脉血管内皮细胞具有干细胞的潜能,并且具有取材容易、来源充足以及操作简便的特点,同时体外获得的人脐静脉血管内皮细胞混杂细胞较少,与各种实验动物来源的血管内皮细胞相比较,更接近人体内皮细胞的生长特点,是体外研究常用血管内皮细胞之一。严重**时,机体释放出大量的炎症介质,如TNF-α、内**、IL-1β、IL-6等,而血管内皮细胞由于其解剖地位决定其极易成为各种炎症介质作用的靶细胞。乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是一种从人尿中提取的精制糖蛋白,其分子量为67000D,由143个氨基酸残基组成,其生物利用度为100%,半衰期4Omin,5min达峰值,属于人内源性的蛋白酶抑制剂。乌司他丁不仅可以通过抑制多种蛋白、糖和脂类的水解酶的活性,起到抑制炎症介质的过度释放,改善微循环和组织灌注等重要的药理作用,从而减少炎性损伤因子等对机体的损伤,维持人体内环境平衡。同时,乌司他丁还具有稳定溶酶体膜,抑制溶酶体酶的释放,抑制心肌抑制因子的产生,**氧自由基的作用。另外,乌司他丁还可一系列作用抑制血小板释放活性物质、维护血小板正常聚集功能、维护血管正常舒缩功能以及维护内皮细胞完整性。部分基础和临床研究显示UTI可以减少****渗漏,减轻组织水肿,具有一定的血管内皮保护作用,因此临床上常被用于严重**、急性胰腺炎、急性肺损伤、全身炎症反应综合征(SIRS)等**。有研究显示,人血浆内存在较高浓度的蛋白酶抑制剂,当机体受到严重损伤如感染、发热、肿瘤、妊娠、休克、手术或给予糖皮质**等刺激时,这种蛋白酶抑制剂会被消耗,浓度出现明显下降,但是随机体的逐渐恢复,其浓度又会逐渐上升,而人体尿液中的UTI活性升高。因此,乌司他丁具有抵抗外来刺激,减少外界损伤因子对机体的损伤,维持人体内环境平衡的作用。既往较多研究结果已证实,乌司他丁对**和保护血管内皮细胞的作用,但是关于乌司他丁是否能影响细胞增殖、凋亡等生理活动则鲜有报道。ERK通路作为MAPK家族中*先被发现并被研究*多的成员,被认为与细胞增殖、转化和分化相关,其包括了两种异构体ERK1和ERK2(分别为P44和P42)。ERK分子内被两个磷酸化受体位点即酪氨酸和苏氨酸被谷氨酸残基分隔开来,故其磷酸化位点基序是TEY。ERK级联反应包括典型的3个层次MAPKs的序贯激活过程。Raf蛋白(MAPKKK)的激活能磷酸化MEK1/2(MAPKK),并使后者激活,从而使随后的ERK1/2(MAPK)发生双重磷酸化而被缉获。ERK的激活对于Ras诱导的细胞反应、转录因子(如Elk1、cEts1和c—Ets2)的激活以及激酶(如P90rsk1、MNK1和MNK2)的激活是至关重要的。目前,较多临床和基础实验已证明,乌司他丁能保护血管内皮细胞,减少炎症介质的释放,但是否具有促进血管内皮细胞的增殖,加快受损血管内皮细胞的修复,缩短血管内皮细胞修复的时间,进而减少血管内液的渗漏等功能仍鲜有报道。由于在机体全身炎症反应过程中,血管内皮细胞所处位置和具有的功能决定了其成为环境刺激因素与生物学行为之间的中介,是内源性**和外源性干预因素的作用靶细胞。因此本实验以血管内皮细胞作为研究乌司他丁的切入点,通过加入不同浓度梯度的乌司他丁,使用目前常用的方法进行检测,观察不同浓度的乌司他丁对人脐静脉血管内皮的增殖、凋亡、迁移、粘附功能的作用,然后再加入**血清和ERK通路抑制剂,进一步观察在炎症状态下乌司他丁是否仍有促进增殖的作用,并初步探究该作用与ERK通路的相关性。乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞生理功能的影响及作用机制初步探讨目的观察不同浓度的乌司他丁溶液对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞增殖、凋亡、迁移、粘附作用的影响,以及与ERK1/2通路的相关性。方法购买进口的经鉴定的原代人脐静脉血管内皮细胞,从液氮取出后经37℃水浴复苏人脐静脉血管内皮细胞后,将细胞置于离心机离心,然后将细胞培养于培养皿内,置于二氧化碳培养箱中进行时培养,隔日换液,待镜下细胞融合80%左右时,加入胰酶进行消化,2分钟后镜下观察细胞出现皱缩,边缘略变圆、彼此分离或呈大片状分离,加入完全培养基终止消化,然后将细胞按照1:2-1:3传代培养。镜下观察细胞状态,选择生长状态较好的人脐静脉血管内皮细胞进行实验。将细胞随机分为对照组U组和实验组A组(625单位/ml)、B组(2500单位／ml)、C组(5000单位/ml)、D组(10000单位/ml),收集处于对数生长期的细胞制成细胞悬液,接种于6孔板内,37℃二氧化碳培养箱培养,待细胞在6孔板中生长至50-60%时,用celltrac e实验检测不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞增殖作用的影响；按照TUNEL实验的说明步骤进行操作,检测不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞凋亡作用的影响；进行划痕实验,分别在0h,6 h,24h,48h的时间点采集图片和数据,计算迁移率,检测不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞迁移作用的影响；进行细胞粘附实验,以BSA组贴壁细胞OD值为参照,计算matrigel和FN组细胞贴壁率,检测不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞粘附作用的影响。再次培养细胞,将细胞随机分为四组,对照组ck为正常人脐静脉血管内皮细胞,实验组a为正常人脐静脉血管内皮细胞加入**血清,实验组b为正常人脐静脉血管内皮细胞加入**血清和乌司他丁(5000单位/ml),实验组c为正常人脐静脉血管内皮细胞加入ERK1/2通路抑制剂、**血清、乌司他丁(5000单位/ml),用celltrace实验检测不同浓度乌司他丁对各组人脐静脉血管内皮细胞增殖作用的影响。对数据行单因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD-t检验、t检验。结果1.不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞增殖作用的影响与对照组相比较,乌司他丁浓度分别为625u/ml、2500u/ml、5000u/ml、10000u/ml的四个实验组中细胞均有增殖,当**浓度为5000u/ml时细胞增殖活动*明显,但是当浓度达到10000u/ml时,细胞的增殖活动较**浓度为5000u/ml的实验组有所减弱。2.不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞凋亡作用的影响与对照组相比较,乌司他丁浓度分别为625u/ml、2500u/ml、5000u/ml时细胞并未出现明显凋亡,当**浓度达到10000u/ml时,凋亡的细胞明显增加。3.不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞迁移作用的影响对照组、乌司他丁浓度分别为625u/ml、2500u/ml、5000u/ml、10000/ml的实验组6h的迁移率分别为4.08±0.01、2.61±0.03、7.24±0.02、3.99±0.04、22.07±0.02,24h的迁移率分别12.53±0.11、13.044±0.03、20.65±0.02、21.37±0.07、30.10±0.02,48h的迁移率分别为20.18±0.04、25.00±0.06、37.92±0.10、49.22±0.07、49.01±0.03,实验组各时间点的迁移率与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4.不同浓度乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞粘附作用的影响以BSA作为参照,测得对照组和乌司他丁浓度分别为625u/ml、2500u/ml、5000u/m1、10000u/ml的实验组粘附率分别为38±0.002、39±0.003、41±0.008、43±0.004、43±0.012,用纤维粘连蛋白(FN)测得的粘附率分别60±0.006、61±0.008、644±0.002、73±0.002、81±0.03,用基质胶(matrigel)测得的粘附率分别为50±0.110、51±0.009、544±0.001、61±0.100、66±0.003,**浓度为625u/ml的实验组的粘附率与对照组相比较,差异无统计学意义(P>0.05),**浓度分别为2500u/ml、5000u/ml、10000u/ml时的实验组的粘附率与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5.乌司他丁对加入**血清和ERK通路抑制剂的人脐静脉血管内皮细胞增殖作用的影响,以及与ERK通路的相关性与对照组相比较,**血清组的正常人脐静脉血管内皮细胞增殖活动受到抑制,而**血清加浓度为5000u/ml乌司他丁的实验组中,人脐静脉血管内皮细胞出现增殖,另外,在**血清加浓度为5000u/ml乌司他丁和ERK1/2通路抑制剂UO126的实验组中,人脐静脉血管内皮细胞出现增殖,但其增殖活动较对照组稍有减弱。1.不同浓度的乌司他丁能促进人脐静脉血管内皮细胞的增殖作用,并且与浓度呈正相关,当**浓度为5000U/ml时,乌司他丁的促增殖作用达到高峰。2.低、中浓度的乌司他丁对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡无影响,但是物浓度为10000U/ml的乌司他丁可导致细胞凋亡3.不同浓度的乌司他丁能促进人脐静脉血管内皮细胞的迁移作用,该作用与浓度呈正相关。4.不同浓度的乌司他丁能促进人脐静脉血管内皮细胞的粘附作用,并且该作用与浓度呈正相关。5.ERK1/2通路参与了乌司他丁的促增殖作用,但并非**途径,乌司他丁可能通过其他信号通路共同影响细胞的增殖活动。