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Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒

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产品名称: Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒
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产品展商: 信裕生物
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简单介绍

Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒适用于检测疑似感染者或发病动物等组织、体液或**结等标本中禽流感病毒rna,用于禽流感病毒感染的辅助诊断,Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒特点优势:1.特异性高、2.重现性好、3.灵敏性强、4.实用性好,厂家现货促销。


Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒  的详细介绍


Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒PCR反应程序

1.常规程序

PCR反应所需的成分配置完后,在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94℃保持30秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般50-60℃之间),一般保持30秒钟,使引物与模板充分退火;在72℃保持1分钟(扩增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环2535次,使扩增的DNA片段大量累积。*后,在72℃保持3-7min,使产物延伸完整,4℃保存。

2.复性(退火)和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素,通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法PCR

3.反应时间

变性步骤一般使用30秒钟,如果模板的G+C含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用1kb1分钟来保证充足的时间。

4.循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为104105数量级时,循环数通常为2535次。

平台效应(plateaueffect):PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTPDNA聚合酶的稳定性或活性降低,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓度扩增产物变性不彻底。

5.PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样,在*后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。

对于使用具3-5’外切活性的高温DNA聚合酶时,有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时,如果将反应成分分开配制,A管含模板、引物和dNTP,以及调整体积的H2OB管含缓冲液、DNA聚合酶和水,然后再将两管溶液混合起来,可较好地克服这个问题。

按照常规的方法配制反应体系,有时会出现非特异性扩增的问题。热启动(hotstartPCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP、缓冲液,Mg2+primer先配制好,然后加入一粒蜡珠(如AmpliWaxPCRQam100),加热熔化,再冷却,使蜡将溶液封住,*后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有当PCR反应进入高温阶段后,蜡层熔化,所有反应成分才会混合在一起。

标准的Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒反应体系:

10×扩增缓冲液 10ul

      4dNTP混合物   各200umol/L

      引物        各10100pmol

      模板DNA 0.12ug

      Taq DNA聚合酶 2.5u

      Mg2+ 1.5mmol/L

      加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC*好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶  核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基,特别是*末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列*好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0.11umol10100pmol,以*低引物 量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量25U(指总反应体积为100ul)Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH1M TrisHCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50200umol/L,尤其是注意4dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA

Mg2+浓度 Mg2+PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA9095℃变性,再迅速冷却至40 60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至7075℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)

①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的*主要原因。一般情况下,93℃~94lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择*适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

Tm(解链温度)=4(G+C)2(A+T)

复性温度=Tm-(510)

Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec,足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:

7080 150核苷酸/S/酶分子

70 60核苷酸/S/酶分子

55 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。

Tsukamurella inchonensis qPCR检测试剂盒反应的延伸温度一般选择在7075℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

循环次数  循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

所有军团菌属qPCR检测试剂盒 Legionella all species 
嗜肺军团菌qPCR检测试剂盒 Legionella pneumophila 
细螺旋体病qPCR检测试剂盒 Leptospirosis 
梅克尔多元癌细胞病毒qPCR检测试剂盒 Merkel cell polyomavirus 
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌qPCR检测试剂盒 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 
莫拉氏菌属(所有)qPCR检测试剂盒 Moraxella (all species) 
卡他莫拉菌qPCR检测试剂盒 Moraxella catarrhalis 
鸟型结核分枝杆菌qPCR检测试剂盒 Mycobacterium avium 
鸟型结核分枝杆菌亚型类结核qPCR检测试剂盒 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis 
结核分枝杆菌qPCR检测试剂盒 Mycobacterium Tuberculosis 
结核分枝杆菌复合群qPCR检测试剂盒 Mycobacterium tuberculosis complex 
肺炎支原体qPCR检测试剂盒 Mycoplasma pneumoniae 
hCoV-EMC / MERS qPCR检测试剂盒 Novel Coronavirus 
新型冠状病毒(所有)qPCR检测试剂盒 Respiratory Syncytial Virus (all species) 
新型冠状病毒A型qPCR检测试剂盒 Respiratory Syncytial Virus type A 
新型冠状病毒B型qPCR检测试剂盒 Respiratory Syncytial Virus type B 
SARS冠状病毒qPCR检测试剂盒 SARS coronavirus 

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