黄曲霉**M1试剂盒
产品介绍
【产品简介】
黄曲霉**是一类**（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉**M1（AFM1）的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。薄层色谱一直是检测黄曲霉**常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉**M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉**M1残留。
黄曲霉**M1试剂盒【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉**M1和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲霉**M1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉**M1的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物黄曲霉**M1的含量。
【试剂盒技术指标】
规 格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.025ppb
检测时间： 75min
样本检测下限：
牛奶……………………………………………0.25ppb
奶粉、奶油、奶酪……………………………0.025ppb
饲料……………………………………………2.5ppb
反应率：
黄曲霉**M1……………………………………100%
黄曲霉**M1试剂盒回收率：
食 品…………………………………………85±10%
饲 料…………………………………………75±10%
【试剂盒组成】
1、 微量测试孔：（1X96孔板）每条8孔，一板12条
1、 标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.1ppb、0.5pp、1ppb、2ppb
2、 酶标记物 12ml…………………………红色帽
3、 抗体工作液 7ml…………………………绿色帽
4、 底物液 A液 7ml…………………………白色帽
5、 底物液 B液 7ml…………………………黑色帽
6、 终 止 液 7ml…………………………黄色帽
7、 20X浓缩洗涤液40ml…………………… 透明帽
8、 5X浓缩样品稀释液50 ml…………………蓝色帽
【所用仪器、试剂】
仪 器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量
0.01g）
微量移液器：单道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl
试 剂：甲醇、正己烷、滤纸
黄曲霉**M1试剂盒【样本前处理步骤】
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1、样品提取液：70%甲醇溶液30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70％甲醇溶液。
配液2、将5X浓缩样品稀释液用去离子水按照1：4稀释（1 份浓缩样品液+4份去离子水）用于样品的稀释。
（a）生鲜牛奶；
1、直接取50μl牛奶+450μl样品稀释液混合30s；
2、取50μl用于检测检测分析。
样本稀释倍数:10
（b）奶粉、奶油、奶酪
1、称取5g样品于50ml离心管中，加入10ml甲醇，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。
2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。
3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的样品稀释液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，
4、取50ul下层溶液进行检测分析。
样本稀释倍数:1
（C）饲料
1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml 的提取溶液混合；强力振荡5分钟。
2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。
3、取出上清液50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s，取50ul进行检测分析。
样本稀释倍数:100
【酶标**分析程序】
测定前应须知：
1、 使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
黄曲霉**M1试剂盒操作步骤：
1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤
液。
4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、 加标准品/样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50μl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。
6、 取出将孔内液体甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被**的气泡可用干净的枪头刺
破）。
7、 每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水
纸拍干（拍干后未被**的气泡可用干净的枪头刺破）。
8、 显色：每孔加入A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
9、 测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸光
度值（OD值）。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与黄曲霉**M1的含量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.350， 样本2的吸光度值为0.890，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.810；0.025ppb为1.550；0.1ppb为1.030；0.5ppb为0.580； 2ppb为0.211。则样本1的浓度范围是0.5ppb-2ppb； 样本2的浓度范围是0.1 ppb-0.5 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉**M1的实际含量。
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以**个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉**M1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉**M1实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
3、标准曲线：
B/B0 (%)
0.025 0.1 0.5 2
黄曲霉**M1(ppb) [μg/kg]
图1：黄曲霉**M1检测试剂盒的回归曲线
4、再现性：
%CV
0 0.025 0.1 0.5 2
黄曲霉**M1 (ppb) [μg/kg]
图2：黄曲霉**M1检测试剂盒的精密度
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出黄曲霉**M1检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉**M1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
【注意事项】
1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行
下一步操作。
3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、 该试剂盒*佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【储存】
原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。
【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。