载体构建实验常见问题大解析
1. PCR
载体构建大部分时候都要通过PCR的方法获取目的片段，扩增PCR的时候大家尽量选用高保真的PCR酶来进行扩增，扩增之前我们首先要了解目的基因序列信息。其次高质量的模板对PCR成功与否也很重要，以质粒作为模板的PCR相对来说*好扩增，基因组DNA和cDNA相对来说较难获取一些。
引物设计工作，一般很多软件都可以进行引物设计，例如pirmer5之类的软件。除了常用的酶切连接的方法也可以使用无缝克隆的方法构建，选用哪种方法我们都要在引物设计的时候考虑到，酶切连接的方法和无缝克隆引物设计注意点如下：
1） 无缝克隆方法设计引物的时候要加入同源重组臂序列。
2） 做酶切连接引物设计要注意加上保护碱基，保护碱基大部分加入4个碱基可以满足大多数内切酶，也可以参照限制性内切酶保护碱基添加表加保护碱基。
在扩增前我们应了解目的片段是否有高GC、或者重复序列之类的特殊序列，还有片段长度都会影响实验，不推荐一次构建片段5K以上的实验，如果片段过长我们可以通过拆分目的片段来分步构建，一定要注意要设计好之前的用到的内切酶位点的设计，片段长度的增加与实验难度是成正比的，如果你的目的片段含有高GC序列，可以加入DMSO之类的辅助剂增加PCR的扩增效率，现在市面上针对高GC等特殊结构的PCR酶也很多，大家也可以用此类的酶扩增，扩增好PCR要进行纯化回收，此步不多讲，一般胶回收试剂盒都能满足要求。
2. 线性化所用载体
很多人习惯先构建到T载体再进行下一步的构建，其实基本直接构建到*终载体成功率也非常高，以下一些注意事项希望能帮大家节省时间直接省略T载体构建一步成功。
线性化载体的时候，*好验证过载体是没有问题的，通常我们单酶切或双酶切的时候要注意内切酶的buffer是否没有用错，一般根据说明书再延长一些时间会使线性化更加彻底，增加载体构建的阳性率，
3. 连接反应
一般载体与目的片段的比例推荐1:1到1:4，使用nanodrop进行定量，通常根据紫外灯通过亮度对比也是可以的，连接反应的时候*好在冰上操作，此步要操作轻柔，载体和片段连接酶之类的加入要混匀，PCR上机反应
4. 转化
转化实验要保证感受态细胞的转化效率，通常实验要求转化之后要加入培养基进行复苏，海创科业小编大量经验验证可以不必复苏，直接涂板，无论是amp抑菌类的***或者kana**类的***都是可以直接涂板的。涂板之后37℃过夜培养即可。
5. 菌落PCR鉴定
做菌落PCR鉴定的时候引物一般选择载体上的通用引物来鉴定，因为选用目的片段两端的引物可能会出现假阳性；操作方法一般挑取单克隆在小的EP管培养4小时左右，培养基出现浑浊的情况即可以进行菌落PCR鉴定，鉴定完成后一般送三四个送测序验证即可，pcr过程可能会发生突变，所以多送几个克隆可以保证我们所要的克隆顺利获得。