慢病毒介导BMPR Ⅱ基因沉默对人肝癌移植瘤生长的影响
目的:探讨BMPR II基因RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒载体对人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤BMPR II基因表达和移植瘤生长的影响。方法:1、前期研究已明确了具有下调BMPR II基因的siRNA干扰序列,设计并合成shRNA oligo,退火后构建入干扰慢病毒载体p L/shRNA/F-BMPR II,用构建的慢病毒载体p L/shRNA/F-BMPR II转染293T细胞,包装慢病毒,并用荧光法测定滴度,用包装的pL/shRNA/F-BMPR II干扰慢病毒侵染HepG2细胞。2、通过实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白印迹(Western Blot)技术检测慢病毒转染后各组细胞中BMPR II mRNA及蛋白水平表达的变化,明确处理后BMPR II沉默的效果。3、建立人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤模型,随机分成实验组、阴性对照组和空白对照组。隔天1次向各组动物肿瘤内分别注射BMPR II shRNA慢病毒颗粒、携带无效序列的慢病毒颗粒和0.9%氯化钠溶液0.2 ml,共5次,测量各组肿瘤体积的大小,绘制肿瘤生长曲线,13天后处死裸鼠。4、应用Western blot及免疫组化技术检测移植瘤中BMPR II蛋白水平表达。结果:1、qRT-PCR及Western bolt检测结果显示:转染组与空白对照组及阴性对照组相比,BMPR II mRNA及蛋白表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。2、绘制裸鼠移植瘤生长曲线显示,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05);空白对照组和阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。空白对照组和阴性对照组剥脱的瘤体体积分别为(1274.6±133.02)mm3和(1255.2±130.05)mm3,而实验组剥脱的瘤体体积为(328.6±87.72)mm33、Western blot及免疫组化技术检测显示:实验组与空白对照组及阴性对照组相比,移植瘤组织BMPR II蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组移植瘤组织相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1、BMPR II shRNA慢病毒载体转染入人肝癌HepG2细胞后,可有效抑制BMPR-ⅡmRNA及蛋白在细胞内的表达。2、BMPR II shRNA慢病毒载体瘤内注射可抑制人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤的生长。