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考马斯亮蓝测蛋白质方法

考马斯亮蓝测蛋白质方法

蛋白质浓度测定的方法有很多,考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室*常见的一种方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作简便,

考马斯亮蓝测蛋白质原理:

考马斯亮蓝G-250(Coomassie?brilliant?blue?G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者*大光吸收在465nm,后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内(1-1000μg),蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。


考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速,2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高,易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

材料、仪器设备及试剂

1、材料

小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料

2、仪器设备<

分光光度计、研钵、烧杯、移液管

3、试剂

(1)标准蛋白质溶液:100μg·Ml-1牛血清白蛋白:称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml,用蒸馏水稀释至100ml即可。

(2)考马斯亮蓝G-250溶液:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml90%乙醇中,加100ml85%(W/V)的磷酸,再用蒸馏水定容到1L,贮于棕色瓶中,常温下可保存一个月。

考马斯亮蓝测蛋白质方法:

(1)标准曲线的绘制?取6支具塞试管,按表加入试剂。混合均匀后,向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,并放置5min左右,在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质

浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定

样品提取:取鲜样0.5g,加入2ml蒸馏水研磨,磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵,洗涤液收集在同一离心管中,在4000r/min下离心10min,弃去沉淀,上清液转入容量瓶,以蒸馏水定容至10ml,摇匀后待测

(2)吸取样品提取液0.1ml,放入具塞试管中(每个样品重复2次),加入5ml考马斯亮蓝<

G-250溶液,充分混合,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量。

(3)结果计算(单位mg/g)样品中蛋白质含量=(C·VT)/(1000?VS·WF)

(参考文献:郝建军,康宗利,于洋,植物生理学实验技术,北京:化学工业出版社,2006.12,107-109)

注意事项

在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是*稳定的。

测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品*好是从低浓度到高浓度测定,防止误差。