组织和细胞活性蛋白怎样提取

组织和细胞活性蛋白怎样提取

一、 试剂盒说明

本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取具有活性的全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液

Lysis Buffer 匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。获得的全蛋白可用于 Western Blot、**共沉淀和酶 的活性的测定的等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶**共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。 应用方面：可用于 Western Blot、**共沉淀和酶活性测定等后续研究.

二、试剂盒组份

组份

KGP1050

50 tests

KGP10100

100 tests

储存温度

Lysis Buffer

50mL

100mL

2-8℃

磷酸酶抑制剂

500μL

1000μL

-20℃

蛋白酶抑制剂

50μL

100μL

PMSF（100mM）

500μL

1000μL

-20℃，避光

三、操作步骤

Ⅰ 实体组织蛋白的提取

1． 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制剂，1 μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF，混匀。冰上保存数分钟待 用。

2．  每 100mg 固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小块，加入 0.5～1 mL 冷 Lysis Buffer，玻 璃匀浆器上下手动匀浆 15 次，注意低温操作；

3． 取组织匀浆液转移到 1.5mL 预冷的离心管，离心 10000 转/分，4℃离心 5 min；

4．  取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。

Ⅱ    培养细胞蛋白提取

1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入 10mL/150mm 培养板的冷 PBS 洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；

2．  悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中，1000 转/分离心 10 min，再用

10mL/150mm 培养板的冷 PBS，1000 转/分离心 5 min 洗两次；

3．  在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制剂，1μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF（用户自配：浓度 100mM， 溶于异丙醇），混匀。冰上保存数分钟待用。

4． 在上述培养板或离心管的细胞中，加入上述配制好的冷 Lysis Buffer，加入量如下表所示：

细胞数量

Lysis Buffer 加入量

107 个

0.5 mL～1 mL

5×106 个

0.2 mL～0.5 mL

5．冷室或冰上操作，贴壁细胞用细胞刮子刮下，皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中；悬浮培养或裂解

前刮下的贴壁细胞皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中，

6．置于 4℃摇床平台上，温和振荡 15 min；

7． 14,000rpm，4℃离心 15min，取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

8．  分装保存于-70℃,避免反复冻融。

四、注意事项

?      所有接触样品的用具及试剂均需预冷。

?      提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性剂